如何操作苯丙氨酸解氨酶(PAL)檢測試劑盒

苯丙氨酸解氨酶(PAL)檢測試劑盒(苯丙氨酸微板法)

產(chǎn)品簡介：

苯丙氨酸解氨酶(L- phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶，該酶多存在于高等植物、酵母、菌類可溶性部分物質(zhì)，是1961年J.Koukol在大麥中發(fā)現(xiàn)的，推測其分子量約為30萬，這是一個可把苯丙氨酸用于酚類化合物合成的酶。在組織中的活性可隨外界因素而發(fā)生顯著變化，用光照、病傷害、植物激素處理等會使活性顯著增加，在多數(shù)情況下在組織中活性增加時，酶發(fā)生失活作用，這時組織中具有活性酶的量很快就會減少，據(jù)認為這種失活是與類蛋白質(zhì)物質(zhì)作用有關(guān)，測定細胞木質(zhì)素合成途徑中間代謝物及關(guān)鍵酶活性,可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

雅吉生物苯丙氨酸解氨酶(PAL)檢測試劑盒(苯丙氨酸微板法)檢測原理是以苯丙氨酸作為底物，在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時間測定產(chǎn)物生成量的方法，于酶標儀290nm 處檢測吸光度，以吸光度變化所需酶量進行計算，主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的苯丙氨酸解氨酶活性,尤其適用于檢測水果中苯丙氨酸解氨酶活性。

該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1、蒸餾水

2、電子天平、研缽或勻漿器、離心管或試管

3、低溫離心機、恒溫箱或水浴鍋、酶標儀、酶標板

操作步驟(僅供參考)：

1、準備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min，留取上清液，-20℃凍存，用于苯丙氨酸解氨酶的檢測。

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，-20℃凍存，用于苯丙氨酸解氨酶的檢測。

③細胞或組織樣品∶取恰當細胞或組織裂解液，如果有必要需進行適當勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min，取上清液，-20℃凍存，用于苯丙氨酸解氨酶的檢測。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙氨酸解氨酶，可以使用蒸餾水或PAL Lysis Buffer稀釋進行恰當?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板，按照下表設(shè)置對照孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并

注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置2平行孔，求平均值。

3、PAL檢測︰

以對照孔為對照(調(diào)零)，酶標儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為   A_測定0);40℃準確孵育1h，立即加入10μl PAL終止液終止反應(yīng)(備選方案)，以對照孔為對照調(diào)零，酶標儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為A_測定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟，可37℃準確孵育1h后直接以對照孔為對照調(diào)零，酶標儀立即測定290nm處測定孔的吸光度。

計算:

PAL活性單位的定義︰在該實驗條件下，每小時吸光度變化0.01所需酶量為一個活性單位。

組織樣品PAL(U)={(A_測定1-A_測定0)×V_T}/(W×V_s×0.01×t)

液體樣品PAL(U)=(A_測定1-A_測定0)/(0.01×t)

式中:

A_測定1=40℃孵育1h后測定孔的吸光度

A_測定0=加入PAL Assay buffer后立即檢測的測定管吸光度

W=組織樣本的重量(g)

V_T=提取酶液的總體積(ml)

V_s=測定時所用酶液體積(ml)

t=反應(yīng)時間(h)=1

注意事項∶

1、待測樣品中不能含有酶抑制劑，同時需避免反復(fù)凍融。

2、獲得上清液為PAL酶液，應(yīng)盡快檢測，亦可-20°℃保存。

3、如果沒有可測定紫外區(qū)的酶標儀和酶標板，也可以使用紫外分光光度計和石英比色皿，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測體積。

4、每次檢測指標不宜過多，否則操作時間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期:6個月有效，4℃運輸，4℃保存。