PCR三個基本反應步驟

標準的PCR三個基本反應步驟：

第一步，DNA變性（90℃-96℃）

雙鏈DNA在高溫作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

第二步，退火（60℃-65℃）

溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

第三步，延伸（70℃-75℃）

在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′到3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增

形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；模板DNA與引 物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后

，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，

以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--

退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，

2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。P

CR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。

Y代表DNA 段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，

 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA 段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，

被擴增的DNA 段不再呈指數(shù)增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應"，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶

PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。