? 實驗技巧 了解細胞轉染

 實驗技巧 | 一文了解細胞轉染

細胞轉染是指將外源分子（如DNA、RNA等）導入真核細胞的技術。目前，其已成為實驗室工作中最常涉及的基本方法，是研究基因表達調控、突變分析等的常規工具。

轉染方法大致可分為物理介導（如電穿孔法、顯微注射和基因槍等）、化學介導（脂質體及其代替物、磷酸鈣等）和生物介導（各類病毒，包括腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒等）三類途徑。

細胞轉染又分為瞬時轉染和穩定轉染，瞬時轉染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上，基因表達維持時間較短，通常在96h以內；

穩定轉染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中，使宿主細胞可長期表達目的基因。

目前，大多采用依據不同質粒載體含有的抗性標志選用相應的抗生素對靶細胞進行篩選，常用的抗生素有嘌呤霉素（Puromycin）、G418（Geneticin）等。

1、主要有下面幾種

化學法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質體法；

物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic顆粒傳遞法；

病毒介導法：逆轉錄病毒、腺病毒

A. 陽離子脂質體法：帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。

特點：簡單通用，適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清，轉染效率隨細胞類型變化大。由于脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞，所以貼壁比懸浮轉染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。

B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔。

C. 逆轉錄病毒（RNA）：通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞，之后反轉錄酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。

特點：穩定轉染，可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等，但攜帶基因不能太大。

D. 腺病毒（雙鏈DNA）：先和細胞表面的受體結合，繼而在αV整合素介導下被細胞內吞。

特點：可用于難轉染的細胞。

2、影響轉染的因素

血清：血清影響復合物的形成，降低轉染效率。

陽離子脂質體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此想在轉染培養基中加入血清時要進行條件優化。大部分細胞可以在無血清培養基中幾個小時內保持健康。

抗生素：比如青霉素和鏈霉素，是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。

細胞代數：轉染前細胞最好經過1-2次傳代保證細胞生長旺盛容易轉染，注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉染。

細胞鋪板密度：一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。

DNA質量：DNA質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成和轉染的進行。