石蠟切片免疫組化如何染色

實(shí)驗(yàn)材料

新鮮組織

試劑、試劑盒

二甲苯 酒精 H2O2 抗原修復(fù)液 枸櫞酸鈉緩沖液 石蠟 福爾馬林 PBS DAB 蘇木素 樹膠 丙酮 打孔液 檸檬酸鈉 APES 

儀器、耗材

恒溫?fù)u床 高壓鍋 塑料切片架 耐溫玻璃容器 -80℃冰箱 恒冷冰凍切片機(jī) 載玻片

實(shí)驗(yàn)步驟

一．石蠟切片免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟：

1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置60℃ 1 小時(shí)）。

（1）二甲苯I、II,各10 分鐘。

（2）梯度酒精：100%，2 分鐘® 95%，2 分鐘® 80%，2 分鐘® 70%2 分鐘。

（3）蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫10 分鐘（避光）。

3．蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

4．抗原修復(fù)：

根據(jù)待檢測的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

附：抗原修復(fù)液（10mM pH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液）的配制

（1）儲(chǔ)備液的配制：

A 液：枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml

B 液：枸櫞酸21g + 蒸餾水1000ml

（2）工作液的配制：A 液82ml + B 液18ml + 蒸餾水900ml

抗原修復(fù)的方法：

（1）高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸,上汽3 分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。

（2）微波處理技術(shù):用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液；再選擇中高或高檔,5 分鐘（. 最佳溫度為92～95℃）

（3）酶消化處理：此略。

抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)：

（1）組織不能干。

（2）選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。

（3）該方法主要用于10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

（4）抗原修復(fù)后至DAB 顯色的過程中，均需用PBS 緩沖液。

5．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

6．正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分（保持組織呈濕潤狀態(tài)）,滴加正常山羊或兔血清（與第二抗體同源動(dòng)物血清）處理，37℃，15 分鐘。