原代細胞培養、復蘇及無菌操作過程

原代細胞的培養

原代細胞的培養是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把di一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。 [1] 常用的原代細胞的培養有組織塊培養和分散細胞培養。組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進行培養。分散細胞培養大致步驟為：將動物組織從機體中取出離散成單個細胞(常用胰蛋白酶)，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。

原代培養是直接從生物體獲取細胞進行培養。由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養創造條件。利用此方法還可直接服務于臨床實踐。例如，用從手術中切除的腫瘤細胞進行原代培養，然后用該培養細胞進行抗癌藥物的篩選，根據腫瘤細胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇有效的化療方案，有可能起到增強療效、降低副作用的作用。

原代細胞的復蘇

1.取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

2.吸出細胞懸液，并加10倍以上培養液。

3.用培養液適當稀釋后接種培養瓶，放入37℃ CO2 培養箱靜置培養。

原代細胞的培養其實與細胞系的培養無多大差別，針對不同的細胞會選擇不同的細胞培養液。

1.培養液選擇 

根據不同的細胞類型和實驗 要求進行培養液的選擇，常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。

加液：培養液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養4h左右加培養液，培養48h后換液。

a.培養時間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養時間最少需要一周以 上的時間，期間可換液或者傳代。

b.換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養期間需要隨時關注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

2.細胞狀態判斷

正常貼壁細胞在培養幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代

原代細胞的傳代、保存

傳一代后的細胞(也可以不傳代直接凍存)培養至80%~90%便可凍存起來供后續實驗用。

凍存液配制:不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實驗室也有自己的凍存方案，常見的方案有:

A: 10%DMSO+90%FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS 

按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過夜)→液氮。

D：無血清凍存液

傳代：依椐細胞的生長狀態，生長的細胞1：2或1：3進行傳代。

細胞培養過程無菌操作

正常的復蘇，換液和傳代操作，最后將培養好的細胞進行相應的實驗即可