人呼腸孤病毒3型探針法熒光定量PCR試劑盒應用

人呼腸孤病毒3型探針法熒光定量PCR試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品核酸模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏性高。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據高度保守區設計，不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量RT-PCR反應。

本產品只能用于科研。

探針法的如下：

一、稀釋標準曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

7.如果有N個樣品，最好設置N+2個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒RNAout或免提取核酸釋放劑。

三、Probe qRT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：（詳見隨貨說明書或向客服咨詢）

數據處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于36。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于36則為陽性。如果在36-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。