載體構建實驗常見問題及解決辦法

1. PCR

載體構建大部分時候都要通過PCR的方法獲取目的片段，擴增PCR的時候大家盡量選用高保真的PCR酶來進行擴增，擴增之前我們首先要了解目的基因序列信息。其次高質量的模板對PCR成功與否也很重要，以質粒作為模板的PCR相對來說先擴增，基因組DNA和cDNA相對來說較難獲取一些。

引物設計工作，一般很多軟件都可以進行引物設計，例如pirmer5之類的軟件。除了常用的酶切連接的方法也可以使用無縫克隆的方法構建，選用哪種方法我們都要在引物設計的時候考慮到，酶切連接的方法和無縫克隆引物設計注意點如下：

1） 無縫克隆方法設計引物的時候要加入同源重組臂序列。

2） 做酶切連接引物設計要注意加上保護堿基，保護堿基大部分加入4個堿基可以滿足大多數內切酶，也可以參照限制性內切酶保護堿基添加表加保護堿基。

在擴增前我們應了解目的片段是否有高GC、或者重復序列之類的特殊序列，還有片段長度都會影響實驗，不推薦一次構建片段5K以上的實驗，如果片段過長我們可以通過拆分目的片段來分步構建。

一定要注意要設計好之前的用到的內切酶位點的設計，片段長度的增加與實驗難度是成正比的，如果你的目的片段含有高GC序列，可以加入DMSO之類的輔助劑增加PCR的擴增效率，現在市面上針對高GC等特殊結構的PCR酶也很多，大家也可以用此類的酶擴增，擴增好PCR要進行純化回收，此步不多講，一般膠回收試劑盒都能滿足要求。

2. 線性化所用載體

很多人習慣先構建到T載體再進行下一步的構建，其實基本直接構建到最終載體成功率也非常高，以下一些注意事項希望能幫大家節省時間直接省略T載體構建一步成功。

線性化載體的時候，驗證過載體是沒有問題的，通常我們單酶切或雙酶切的時候要注意內切酶的buffer是否沒有用錯，一般根據說明書再延長一些時間會使線性化更加徹di，增加載體構建的陽性率，

3. 連接反應

一般載體與目的片段的比例推薦1:1到1:4，使用nanodrop進行定量，通常根據紫外燈通過亮度對比也是可以的，連接反應的時候在冰上操作，此步要操作輕柔，載體和片段連接酶之類的加入要混勻，PCR上機反應

4. 轉化

轉化實驗要保證感受態細胞的轉化效率，通常實驗要求轉化之后要加入培養基進行復蘇，海創科業小編大量經驗驗證可以不必復蘇，直接涂板，無論是amp抑菌類的抗生素或者kana殺菌類的抗生素都是可以直接涂板的。涂板之后37℃過夜培養即可。

5. 菌落PCR鑒定

做菌落PCR鑒定的時候引物一般選擇載體上的通用引物來鑒定，因為選用目的片段兩端的引物可能會出現假陽性；操作方法一般挑取單克隆在小的EP管培養4小時左右，培養基出現渾濁的情況即可以進行菌落PCR鑒定，鑒定完成后一般送三四個送測序驗證即可，pcr過程可能會發生突變，所以多送幾個克隆可以保證我們所要的克隆順利獲得。